Gensynthese is het biologische proces waarbij nieuwe genen worden opgebouwd en samengesteld uit nucleotiden. Kunstmatige gensynthese, of synthetische gensynthese, verschilt van de DNA-synthese die plaatsvindt in levende cellen. Het belangrijkste verschil is dat er geen prototype-DNA nodig is. Het maakt de creatie mogelijk van synthetische DNA-moleculen die geen beperking kennen in grootte of volgorde van hun nucleotiden. Bovendien kan elke sequentie worden gekopieerd en gesynthetiseerd, ongeacht of deze van nature voorkomt of niet. De studie en vooruitgang in gensynthese hebben geleid tot grote doorbraken in de biologie, waardoor wetenschappers nu gemakkelijk complete genomen en cellen kunnen herprogrammeren.
De wetenschappelijke voordelen van gensynthese zijn onder meer:
- Gensynthese is door onderzoekers gebruikt om de omstandigheden te identificeren waaronder borstkankertumorcellen zich vermenigvuldigen. Dit heeft de basis gevormd voor het creëren van therapieën die kanker effectief kunnen behandelen.
- Wanneer wetenschappers virale sequencing uitvoeren met behulp van kunstmatige gensynthese, produceert dit veiligere en effectievere op DNA gebaseerde vaccins.
- De Chanel-rodopsinevariant maakt het mogelijk om diepliggende neuronen te activeren via niet-invasieve optische activering.
- Plantenbiologen kunnen gensynthese gebruiken om ontwikkelingsherprogrammering in vaatweefsels van planten te bestuderen. Bij het uitvoeren van dergelijke onderzoeken kan bevriezing worden gebruikt om genmonsters te helpen bewaren. Met dit in gedachten, Kijk eens naar deze vriesdrogers die ideaal zijn voor het conserveren van temperatuurgevoelige materialen.
Stappen gevolgd bij gensynthese
Wetenschappers volgen een proces van vijf stappen wanneer ze gensynthese uitvoeren. De vijf stappen zijn:
- Oligo-ontwerp en sequentie-optimalisatie
- Oligo-synthese
- Gen-assemblage
- Verificatie en correctie
- Bereiding van het synthetische DNA
1. Oligo-ontwerp en sequentie-optimalisatie
De eerste stap in het proces is het kiezen van het gen dat u interesseert. Nadat je het gen hebt geïsoleerd, moet je de sequentie creëren die je wilt synthetiseren. Als u bijvoorbeeld de expressieniveaus van heterologe eiwitten wilt maximaliseren, is het optimaliseren van de codons het ideale pad. Aan de andere kant is dit proces misschien niet nuttig als je de interne regulatie van genexpressie wilt bestuderen. Hier zijn de meest populaire tools die worden gebruikt voor het Oligo-ontwerpproces, en hun voor- en nadelen:
- DNA werkt: het is gemakkelijk te gebruiken en kan de uitkomst van Oligo-mishybridisatie voorspellen. De op simulatie gebaseerde scores bieden echter mogelijk geen nauwkeurige weergave van het daadwerkelijke succes bij de montage.
- Gene2Oligo: De interface is eenvoudig te gebruiken en heeft zowel LCR- als PCR-gebaseerde assemblages. Aan de andere kant heeft het geen nut als je gen langer is dan één kilobyte.
- TMPrime: TMPrime: Het biedt zowel LCR- als PCR-gebaseerde assemblages en een breed scala aan smelt- en uitgloeitemperaturen. De enige tekortkoming is dat onervaren gebruikers de interface ingewikkeld kunnen vinden. De gebruikers moeten verschillende invoerparameters begrijpen voor nauwkeurige inzendingen.
Wanneer je de sequentie die je wilt synthetiseren hebt voltooid, is de volgende stap het verdelen van het gen in kleinere fragmenten om te synthetiseren en samen te stellen. Factoren die deze stap beïnvloeden zijn onder meer de lengte van de oligo, de neiging tot haarspeldvorming en herhalingen van sequenties.
2. Oligo-synthese
De eerste stap in de DNA-synthese is het vormen van korte oligonucleotiden. Wetenschappers bereiken dit door fosforamidietchemie te gebruiken om nucleotidemonomeren aan elkaar toe te voegen. De fosforamidietchemie is gunstig omdat het voorkomt dat de groeiende streng ongewenste reacties ondergaat tijdens het vormingsproces. Ze combineren de fosforamidietgroep met de 3'O om ongewenste vertakking tijdens de vorming te voorkomen. De fosforamidietgroep bevat di-isopropylamine, dat bescherming biedt, en gemethyleerd fosfiet. De vierstaps fosforamidietreactiecyclus is als volgt:
- Ontscherming: Hier verwijderen ze DMT door te wassen met een mild zuur zoals trichloorazijnzuur. Dit stelt de 5'O bloot voor reacties.
- Koppeling: De 3'O van het tweede nucleotide bindt met de 5'O van het eerste nucleotide.
- Capping: Hier helpen alle 5'OH's van elk nucleotide dat geen acoliet is, op zo'n manier dat het verderop in het proces geen ongewenste reacties veroorzaakt.
- Oxidatie: Hier voegen ze jodium toe, waardoor een fosfodiësterbinding ontstaat uit de fosfaat-triësterbinding, wat leidt tot het creëren van de ruggengraat van het DNA.
Experts voeren deze stap uit met behulp van een laboratoriumkolom of een gespecialiseerde synthesizer.
3. Gen-assemblage
De stap heeft tot doel de gefragmenteerde Oligo's samen te voegen tot complete genen of bouwstenen voor genomen. Vier soorten assemblage zijn nuttig bij genassemblage. De effectiviteit van de genassemblagemethode hangt af van de lengte van de sequentie die ze willen combineren. De meest voorkomende montagemethoden zijn:
- Ligase-kettingreactie of LCR: Ze gebruiken DNA-ligase om de overlappende uiteinden van synthetische oligo's met elkaar te verbinden.
- Polymerase Chain Assembly: ze combineren alle gestrande Oligos in één buis, en vervolgens doen ze thermocycling om het verbinden te vergemakkelijken.
- In vivo homologe recombinatie in gist: Ideaal voor lange nucleotidestrengen tot 200 nucleotiden en 1000 bp.
- Sequentie- en ligatie-onafhankelijke klonering: ze gebruiken een plasmidevector om maximaal vijf genfragmenten samen te stellen. Ze doen dit door het in de plasmidevector op te nemen.
4. Verificatie en correctie
De vierde stap omvat het verifiëren van de gemaakte reeks en het corrigeren van eventuele fouten die tijdens het proces kunnen zijn opgetreden. Het omvat ook het testen van alle sequenties voordat ze worden vrijgegeven voor gebruik. Alle sequenties die mutaties hebben, worden uit de verzamelde verzameling verwijderd. Andere processen die deel uitmaken van kwaliteitscontrole zijn onder meer:
- inserties
- Verwijderingen
- Voortijdige beëindiging
Soms kunnen de experts niet de juiste sequentie verkrijgen uit de verzameling gesynthetiseerd DNA voor amplificatie. Hier gebruiken ze verschillende methoden om fouten op te sporen en te corrigeren. De wetenschappers zouden kunnen besluiten om strenge hybridisatie van scherp ontworpen Oligo's toe te passen. Ze zouden ook kunnen kiezen voor elektroforese als uitputtende zuiveringsmethode. Een andere haalbare optie is massaspectrometrie. De biochemische methode die ze gebruiken hangt af van hoe succesvol ze voorspellen dat deze zal zijn bij het zuiveren van het DNA.
Andere methoden die ze gebruiken zijn onder meer mismatch-binding, ook wel bekend als mismatch-splitsing. Hier gebruiken ze prokaryotische endonucleasen, een proces waarbij functionele tests worden gebruikt om de juiste sequenties te corrigeren.
Voordat u het proces ingaat, is het raadzaam om te begrijpen dat slechts ongeveer een derde van het totale gesynthetiseerde product van de gewenste kwaliteit zal zijn. Om het proces te vereenvoudigen, klonen ze alleen strengen waarvan is vastgesteld dat ze geen fouten bevatten. Werken met een laboratorium of programma dat het begrijpt
5. Bereiding van het synthetische DNA
Dit is de laatste stap in het proces. Hier wordt het synthetische DNA klaargemaakt voor verdere toepassingen. Verschillende processen maken deel uit van deze voorbereiding voor gebruikerseindtoepassingen:
- Klonen: Ze klonen de synthetische genen in bruikbare vectoren, waaronder plasmide- of virale vectoren. Soms ontwerpen de experts synthetische genen die enzymplaatsen, recombinante armen en andere aangrenzende sequenties beperken.
- Voortplanting: De synthetische genen zijn om verschillende redenen moeilijk te vermeerderen. Ten eerste vinden experts het moeilijk om plasmideconstructen met een laag aantal kopieën te amplificeren met behulp van bacteriële gastheren. Ook veranderen sommige genen de fysiologie van hun gastheren, en ten slotte putten lange genen de gastheercel uit vanwege de energielast die ze erop uitoefenen. Soms hebben de experts te maken met genen die bij bepaalde gastheren giftig zijn en bij andere onschadelijk. Wetenschappers zullen proberen de ideale bacteriële gastheer te identificeren voor het succes van het voortplantingsproces.
- Bioveiligheid: Ten slotte zullen de relevante instanties rapporten ontvangen over het gebruikte proces, het bewijsmateriaal beoordelen en bepalen of het resulterende product veilig is voor de algemene bevolking. Het Recombinant DNA Adviescomité beoordeelt bijvoorbeeld de protocollen om ervoor te zorgen dat de veiligheid wordt gehandhaafd en dat het product geen risico voor het milieu oplevert.
Conclusie
Gensynthese is zeer nuttig als het op de juiste manier wordt uitgevoerd. Deze vijf stappen begeleiden u door het proces. Als u erover denkt om voor welk doel dan ook een synthetisch gen te maken, zorg er dan voor dat u contact opneemt met deskundigen om er zeker van te zijn dat u de juiste stap in de meest nauwkeurige volgorde volgt.